摘 要：目的 基于HPLC-Q/TOF-MS系統解析保陰煎化學物質組。方法 采用 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，柱溫30℃，體積流量1.0 mL/min，進樣量10μL，質譜條件為X500R QTOF質譜儀，電噴霧離子源，正、負離子模式掃描。結果通過對照品確認、高分辨質譜數據分析及文獻比對，共鑒別出52個化學成分，包括17個黃酮類、6個酚酸類、12個環烯醚萜類、8個生物堿類、1個苯乙醇苷類、4個單萜類、2個三萜類及2個其他類成分。結論 建立的方法可系統、準確、快速地鑒定保陰煎中的多種化學成分，為后續保陰煎質量屬性的確定提供了依據。

保陰煎出自明代張介賓?《景岳全書》，由白芍、生地黃、熟地黃、山藥、川續斷、黃芩、黃柏、生甘草8味藥組成，臨床常用于男婦帶濁遺淋、色赤帶血、脈滑多熱、便血不止及血崩血淋，或經期太早，凡一切陰虛內熱動血等癥[1]，該方現今仍廣泛應用[2-7]，但對其化學成分的研究未見報道，致使其質量無法得到控制，經典名方物質組辨識是制定質量標準的物質基礎，近年來，液質聯用技術在中藥復方物質組快速識別中發揮著至關重要的作用[8]，為經典名方物質組研究提供了強有力的技術支撐，本實驗采用HPLC-Q/TOF-MS技術，通過對照品比對，結合準分子離子、二級碎片離子信息及相關文獻，共鑒別出52個化學成分，包括17個黃酮類、6個酚酸類、12個環烯醚萜類、8個生物堿類、1個苯乙醇苷類、4個單萜類、2個三萜類及2個其他類成分，進一步明確保陰煎的物質基礎，為質量屬性研究提供了實驗數據的支持。

1 儀器與試劑

ExionLC AC液相色譜儀、X500R QTOF質譜儀（美國Sciex公司）；AB204-N電子天平（德國Meteler公司）；BT25S電子天平（德國公司）；MB-1-2封閉式調溫加熱器（北京科偉永興儀器有限公司）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技公司）。

芍藥苷（批號MUST-）、梓醇（批號MUST-）購自成都曼斯特生物科技有限公司；毛蕊花糖苷（批號11530-201713）、黃芩苷（批號110715-200514）、鹽酸黃柏堿（批號11895- 201504）、鹽酸小檗堿（批號110713-201613）、川續斷皂苷VI（批號111685-201707）、甘草苷（批號111610-201607）、甘草酸銨（批號110731-201619）購自中國食品藥品檢定研究院，所有對照品質量分數均大于98%；色譜純甲酸、乙腈、甲醇購自天津康科德科技有限公司；純凈水（杭州娃哈哈飲用水有限公司）；保陰煎物質基準（自制，以古籍記載的制備方法為依據制備而得的中藥藥用物質基準，也是衡量制劑與中醫臨床所用藥用物質是否一致的標準[9]）：白芍、生地黃、熟地黃、山藥、川續斷、黃芩、黃柏、生甘草8味藥材飲片均由安徽億帆醫藥股份有限公司提供，經天津藥物研究院中藥現代研究部張鐵軍研究員鑒定，均符合《中國藥典》2015年版一部有關規定。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取保陰煎物質基準0.034 g，置10 mL量瓶中，加水8 mL，超聲使溶解，加水至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取黃芩苷、川續斷皂苷VI、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿、芍藥苷、梓醇、毛蕊花糖苷、甘草苷、甘草酸銨各對照品適量，加甲醇制成質量濃度為65.2、14.5、11.3、90.4、59.0、15.9、9.83、10.14、12.5 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為迪馬 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫條件為0～8 min，2%～5% A；8～22 min，5%～15% A；22～40 min，15%～35% A；40～45 min，35%～65% A；45～50 min，65%～100% A；50～60 min，100% A；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min。

2.4 質譜條件

Sciex X500R QTOF質譜儀，正、負離子2種模式掃描測定，儀器參數如下：采用電噴霧離子源；霧化氣413.7 kPa，輔助氣413.7 kPa，氣簾氣206.8 kPa，霧化溫度600 ℃，正負離子分別進行全掃描（ESI），掃描質量范圍m/z50～1 800；正離子模式下，毛細管電壓5 500 V，負離子模式下的毛細管電壓4 500 V，碎裂電壓40 V。

2.5 實驗結果

通過對照品確認、文獻比對及高分辨質譜數據分析，共鑒定出52個化學成分，包括17個黃酮類、6個酚酸類、12個環烯醚萜類、8個生物堿類、1個苯乙醇苷類、4個單萜類、2個三萜類、2個其他類成分?？傠x子流圖見圖1，具體成分信息見表1。

2.5.1黃酮類化合物 黃酮類化合物在植物體中大部分以游離形式或與糖結合成苷類或以碳糖基的形式存在，黃酮類化合物在質譜條件下，斷裂方式主要有CO、CO2等中性離子丟失、RDA裂解及糖基斷裂。保陰煎物質基準中共鑒定出17個黃酮類化合物，包括化合物7、42～44、46、55～63、65、67、72，以58號峰黃芩苷為例，保留時間為41.109min，根據負離子模式下，一級質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z 445.076 4，進一步進行二級質譜掃描，碎片離子為m/z269.043 2，比準分子離子峰少176，是由于準分子離子丟失C6H8O6后形成的碎片，同理，正離子模式下，其準分子離子峰為m/z 447.0918，碎片離子為m/z271.060 3也是由準分子離子峰丟失C6H8O6后形成的碎片，根據其裂解方式，并與對照品比對，鑒定該化合物為黃芩苷?？赡艿牧呀馔緩揭妶D2。

2.5.2 酚酸類化合物 酚酸類化合物在負離子模式下主要以 [M－H]?的準分子離子峰形式存在，主要發生CO2或H2O分子的中性丟失。當結構中含咖啡酸時，易出現咖啡?；膩G失，當化合物結構中含阿魏酸時，易出現阿魏?；膩G失。保陰煎物質基準中共鑒定出6個酚酸類化合物，包括化合物29、31、32、51、53、54，以綠原酸為例，根據負離子模式下，一級質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z 353.087 2，其碎片離子為m/z191.055 0，由準分子離子峰丟失奎寧?；?，根據其斷裂方式，鑒定該化合物為綠原酸?？赡艿牧呀馔緩揭妶D3。

2.5.3 環烯醚萜類化合物 環烯醚萜類化合物主要以 [M－H]?、[M＋HCOO?]?的分子離子峰形式存在，主要發生H2O、(CH2O)n等中性離子及Glc、TPT、MTP的斷裂，保陰煎物質基準中共鑒定出12個環烯醚萜類化合物，包括化合物5、8、11～13、18、21、23、34、35、49、50，以梓醇為例，保留時間為8.074min，根據負離子模式下，一級質譜信息顯示，其準分子離子峰為407.119 1 [M＋HCOO?]?，m/z 361.114 3的碎片離子為 [M－H]?，進一步進行二級質譜掃描，碎片離子為m/z199.061 1，為丟失Glc所致，根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為梓醇?？赡艿牧呀馔緩揭妶D4。

2.5.4 生物堿類化合物 季銨型生物堿類多數會發生RDA裂解、重排及丟失CH3、H2O等中性碎片分子，保陰煎物質基準共鑒定出8個生物堿類化合物，包括化合物19、20、22、24、26、28、36、48，以小檗堿為例，保留時間為35.567 min，一級質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z336.120 7，進一步進行二級質譜掃描，碎片離子為m/z 321.095 7，是由于準分子離子丟失CH3后形成的碎片，碎片離子m/z292.093 3為準分子離子峰失去2CH3所致，根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為小檗堿?？赡艿牧呀馔緩揭妶D5。

2.5.5 苯乙醇苷類化合物 苯乙醇苷類化合物主要發生糖基、?；鹊膩G失，保陰煎物質基準中共鑒定出1個苯乙醇苷類化合物，保留時間為34.112 min，其中m/z 623.197 9為準分子離子峰，碎片離子m/z461.166 1為準分子離子峰失去咖啡?；?，碎片離子m/z 161.028 3為準分子離子峰失去MPT所得，根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為毛蕊花糖苷?？赡艿牧呀馔緩揭妶D6。

2.5.6單萜及其苷類化合物 單萜及其苷類化合物產生的分子離子峰較多，如[M－H]?、[M＋HCOO?]?、[M＋NH4]＋等，易丟失H2O及CH2O分子，或失去糖基分子，質量數為121的碎片離子為苯甲酸碎片離子，該碎片較為常見。保陰煎物質基準中共鑒定出4個單萜類化合物，包括9、38、39、47，以芍藥苷為例，保留時間為30.656 min，其分子離子峰為m/z 479.156 2，碎片離子m/z449.144 9為準分子離子峰脫去1分子HCHO形成的，碎片離子m/z 121.029 5為斷裂的苯甲酸分子，根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為芍藥苷?？赡艿牧呀馔緩揭妶D7。

2.5.7 三萜皂苷類化合物 五環三萜類的裂解多數為RDA裂解及C環裂解。保陰煎物質基準中該類化合物僅有川續斷皂苷VI、甘草酸，川續斷皂苷VI保留時間為44.213 min，分子離子峰為m/z927.495 5，碎片離子m/z 603.388 6為分子離子失去2個糖基所得，碎片離子m/z 323.098 4即為失去的2個糖基，根據裂解規律，并與對照品比對，鑒定該化合物為川續斷皂苷VI?？赡艿牧呀馔緩揭妶D8。

2.5.8 其他類結合碎片信息及文獻比對，還鑒定出1個鞣質類化學成分沒食子酰蔗糖或異構體，1個有機酸類化學成分檸檬酸。

3 討論

本實驗考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水，發現以乙腈-0.1%甲酸水為流動相時，由于檢測波長為230 nm，色譜圖后半部分會出現塌陷，因此再對色譜條件摸索時，用的流動相為乙腈-0.1%磷酸水，考慮需要HPLC-Q- TOF/MS對物質組進行識別鑒定，最終在色譜條件摸索完成后，將流動相定為乙腈-0.1%甲酸水。

本實驗采用HPLC-Q/TOF-MS對物質組進行研究，鑒定出的化學成分主要以黃酮類成分、環烯醚萜類成分、酚酸類成分、生物堿類成分、單萜類成分為主，其中黃酮類成分多數來源于黃芩，環烯醚萜類成分多數來源于生地黃、熟地黃，酚酸類多數來源于續斷和黃柏、生物堿類成分均來源于黃柏，單萜類成分多數來源于白芍，物質基準中各成分都是各中藥中含量高的主要成分，說明本實驗室自制的保陰煎物質基準未失去各味藥的主要成分，也未產生新的成分。研究發現在ESI (＋) 與ESI (?) 2種模式下，黃酮類成分、單萜類成分均有響應，環烯醚萜類成分和酚酸類成分多數在ESI (?) 模式下響應較好，生物堿類成分多數在ESI (＋) 模式下響應較好。

通過HPLC-Q/TOF-MS技術可快速識別鑒定保陰煎物質基準成分群，進一步明確了保陰煎的物質基礎，為其質量屬性的研究奠定了基礎。而對于未鑒定出的化合物，還有待以后深入研究。

參考文獻（略）

來 源：馬文鳳，劉 麗，何樞衡，姚杭琦，洪美閑，張紀紅，張鐵軍，許 浚. 基于HPLC-Q/TOF-MS的經典名方保陰煎化學物質組快速辨識研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(17):4181-4187.